Q：RNase H活性对反转录反应的影响？

A：RNase H活性能够催化降解DNA/RNA 杂交体中的RNA。RNase H活性缺失避免了第一链cDNA 合成反应中DNA/RNA 杂交体中模板RNA被降解，从而保证第一链cDNA 的合成量和长度。

Q：不同温度下的反转录反应有何差别？

A：一般的反转录酶的适宜反应温度是42℃，但是对于某些GC含量高的基因或二级结构复杂的基因，在42℃不足以打开二级结构，使cDNA合成无法顺利进行。此时需要用耐高温的反转录酶，如TransScript ® II RT或TransScript ®-Uni RT，在高温 (≤55℃或≤65℃)条件下进行反转录以获得较好的结果。

Q：RT-PCR后，无PCR产物的原因？

A：在反转录反应前一定要电泳验证RNA的完整性，确认RNA没有降解。RNA不要保存时间过长，尽快进行反转录及PCR操作。

Q：基因克隆测序后经常发生突变的原因？

A：从cDNA进行基因克隆时，突变有可能发生在反转录过程，也可能发生在PCR过程中。一般用保真性高的Taq酶或者Pfu酶进行扩增，循环数不要太高；可通过增加模板量、减少循环数降低突变机率。为保证反转录时的保真性，请选择保真性高的反转录酶。

Q：RT-PCR时模板一般使用多少？

A：反转录反应体系为20μl时，用50 ng-5μg /5-500 ng Total RNA/mRNA进行反转录，RT-PCR用1/20-1/10 PCR体积 (2.5-5μl) 的反转录产物作为PCR模板 (50μl反应体系)。