Q：Passive Reference Dye的作用是什么，如何使用？

A：它们是针对不同机器型号校正加样管间误差的参比荧光染料。它们的浓度为50×，使用时在20μl体系中加入0.4μl即可。

Q：CT值出现过晚？

A：可能是扩增效率低，反应条件不够优化。此外PCR各种反应成分的降解或者PCR产物太长 (一般采用80-250 bp的产物长度) 也会造成CT值出现过晚。

Q：qPCR SuperMix是否需要调整Mg2+浓度？

A：一般不需要调整，当PCR结果不理想或通过其它调整不能获得明显改善时，可以考虑通过调整Mg2+浓度以改进扩增结果。

Q：扩增曲线异常？

A：

• 基线设置有误。

• 高浓度的模板会导致CT值过早出现，即基线范围变小，导致机器读取荧光数值有误。

Q：重复性差？

A：

• 操作误差。

• 模板浓度过低会导致重复性变差，可适当提高模板浓度，降低稀释倍数。

• 机器本身的孔间温度不一致。

Q：NTC不为零，如何优化？

A：

• 提高退火温度。

• 降低引物工作浓度，如需要可降至60 nM。

• 尽量在冰上操作。

• 重新设计引物，必要时可设计多对引物，优中选优。